Cryopreservation
1. Pioneers of Cryopreservation
Christopher Polge
James Lovelock
Peter Mazur
16 Aug 1926 ~ 17 Aug 2006
Glycerol
C.Polge,A. Smith, A. Parkes,
Nature 164, 666 (1949)
26 Jul 1919 ~ 26 Jul 2022
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) ~ 1.4M
J. Lovelock, M. Bishop,
Nature 183, 1394 (1959)
3 Mar 1928 ~ 30 Dec 2015
Sucrose
P. Mazur, J. Farrant, S. Leibo, E. Chu, Cryobiology 6, 1 (1969)
Polge 연구팀은 Glycerol이 세포 내부 얼음 형성을 효과적으로 억제한다는 사실을 최초로 발견하며, 투과성 동결보호제 (Permeating CPA)의 개념을 확립하였습니다. 이 발견은 세포 내부까지 침투하여 얼음 핵을 억제한다는 새로운 가능성을 제시하였고, 이후 정자·혈액세포·배아 등 다양한 생체시료의 동결보존 기술 발전에 전환점을 마련하였습니다.
Lovelock은 이어서 DMSO가 Glycerol보다 빠르게 세포막을 통과하며, 냉각 과정에서 세포막 구조를 안정화하는 메커니즘을 규명하였습니다. 특히 삼투적 탈수, 막 손상, 세포 내부 얼음 형성(IIF)을 정량적으로 설명함으로써, 어떤 속도로 냉각해야 세포 손상을 최소화 하는지에 대해 기반을 다졌습니다.
Mazur는 더 나아가 Sucrose와 같은 비투과성 CPA가 세포 외부에서 삼투압 조절과 얼음 재결정화 억제에 기여한다는 사실을 밝혀, 냉각–저장–해동 전 과정의 물리적 원리를 정량적으로 정립하였습니다.
이처럼 Glycerol, DMSO, Sucrose 세 가지 대표적 CPA와 그 작용 원리에 대한 Polge, Lovelock, Mazur의 연구는 오늘날 세포 동결보존 기술의 기초를 이루고 있으며, 다양한 세포 치료제부터 줄기세포·유전자 보관까지 폭넓은 분야에서 과학적 기반으로 활용되고 있습니다.
2. Cell Preservation Process - Temperature Curve
G.Moll, R. Chinnadurai et al. Curr. Stem. Cell Rep., 8, 72 (2022)
세포 동결보존 과정은 냉각 (Freezing), 저온 저장 (Cryostorage), 해동 (Thawing), 세 단계로 나누어집니다. 먼저, 냉각 단계에서는 실온에서 출발하여 약 –1°C/min 이하의 속도로 서서히 온도를 낮추며 Seeding Temperature에서 얼음핵이 형성됩니다. 세포 외부가 먼저 얼면서 용질이 농축되고, 세포 내부에서는 삼투압 차이에 의해 수분이 빠져나가 탈수가 일어납니다. 냉각 속도가 너무 빠르면 세포 내부에 얼음이 형성되어 세포소기관이 물리적으로 파괴되고, 너무 느리면 세포가 과도한 탈수를 겪어 삼투 스트레스로 손상됩니다. 따라서 이 단계에서는 냉각 속도의 균형이 매우 중요합니다.
다음으로, 저온 저장 단계는 세포의 대사를 사실상 정지시킨 채 –80°C 이하, 또는 액체질소 온도인 –196°C에서 보관하는 구간입니다. 이 구간에서는 온도 안정성이 세포 생존의 핵심 요인으로, 저장 중 발생하는 미세한 온도 변화는 얼음의 재결정화를 유도해 세포막 손상을 일으킬 수 있습니다. 따라서 안정적인 극저온 환경을 유지하는 것이 장기 보존의 필수 조건입니다.
마지막으로, 해동 단계에서는 0°C 부근에서 얼음이 녹기 시작하며, 이후 약 45°C/min의 빠른 속도로 해동이 진행됩니다. 일반적으로 37°C의 water bath을 사용해 짧은 시간 내에 완전히 녹이는 것이 이상적입니다. 해동 속도가 느릴 경우 얼음이 다시 성장하거나 재결정화되어 세포막을 손상시킬 수 있지만, 빠른 해동은 얼음 구조를 단시간에 용해시켜 삼투 스트레스와 재결정화를 최소화합니다.
3. The Need for Cyoprotectants – Cellular Injury During Cryopreservation
E.J. Woods and S. Thirumala, et al. Cytotherapy, 18(6), 697-711. (2016)
세포 또는 조직은 동결보존 과정에서 급격한 온도변화와 화학적 ·물리적 스트레스에 노출되며, 이러한 요인들이 복합적으로 작용해 세포 손상을 유발합니다. 대표적인 손상으로는 Osmotic Intolerance, Cryoprotectant Toxicity, Chilling / Cold shock, 그리고 Intracellular Ice Formation이 있습니다.
Osmotic Intolerance는 동결보호제를 세포 내외에 첨가하거나 제거하는 과정에서 발생하는 급격한 삼투압 변화로 인해 세포가 부풀거나 수축하는 현상을 말합니다. 두번째로, Cryoprotectant Toxicity는 DMSO나 Glycerol과 같은 투과성 동결보호제가 세포 내로 침투할 때 나타나는 화학적 손상을 의미합니다. Chilling / Cold shock은 세포가 낮은 온도에 급격히 노출될 때 발생하는 막 유동성 저하와 지질 과산화(lipid peroxidation) 현상으로, 이로 인해 세포막 구조가 경직되고 대사 반응의 불균형이 초래됩니다. 마지막으로, 세포 내 얼음 형성은 동결 과정에서 세포 내부에 직접 얼음 결정이 생성되는 현상으로 이는 세포와 세포소기관의 막 구조를 물리적으로 파괴하는 가장 치명적인 손상입니다.
결국 이러한 네 가지 손상 기전은 서로 독립적으로 작용하기보다는 상호 연관되어 세포 생존율을 결정짓습니다. 따라서 성공적인 세포 동결보존을 위해서는 세포 및 조직이 네 가지 손상 요인으로부터 균형 있게 보호받을 수 있도록 시스템적으로 제어하는 데 있습니다.
4. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) as a Standard Cryoprotectant with Unsolved Limitations
Astrocyte, Cytotoxicity Test after 24h Incubation
M. Xiao, et al. PlOS one, 9, e107447. (2014)
가장 광범위하게 사용되는 동결보호제인 DMSO는 세포막을 투과할 수 있는 저분자 극성 용매로, 세포 내 수분의 일부를 대체하거나 수소결합 구조를 교란하여 세포 내 얼음 결정 형성 (Ice Nucleation)을 억제합니다. 그 결과 세포 내 탈수 및 얼음 성장으로 인한 기계적 손상을 완화할 수 있습니다.
Standard Cryoprotectant로 사용되어 온 DMSO의 효과는 농도에 의존하는데, 이에 따라 세포의 형태도 변화합니다. 위의 결과에서 0% DMSO에서는 세포들이 밀집되어 균일하게 분포하며 정상적인 polygonal 형태를 유지하고 있는 반면, 5% DMSO에서는 세포 수와 밀도가 현저히 감소하고, 세포가 둥글게 수축되거나 배양 표면으로부터 떨어져나가는 detachment 현상이 뚜렷하게 관찰됩니다. 이는 DMSO 농도가 높아질수록 세포막의 안정성이 무너지고, 삼투 불균형으로 인한 손상이 가속화됨을 의미합니다. 또한, 배양된 Astrocyte에 DMSO를 농도별로 24h 동안 Incubation한 후 Cell Viability를 측정한 결과에서도 농도가 높아질수록 세포 독성이 증가하는 것을 통해 장기간 바이오 제품 보존에는 적합하지 않음을 확인할 수 있습니다.
5. Ice - Binding Antifreeze Protein Yet Limited in Application
대표적인 Ice-Binding Protein에는 Antifreeze protein이 있습니다. Antifreeze protein, AFP는 생체 유래 단백질로, 얼음 결정 표면에 결합하여 얼음 성장을 억제합니다. AFP는 기원과 구조에 따라 여러 클래스로 분류되며 얼음의 Basal, Prism, 그리고 Pyramidal plane 등 다양한 표면에 결합합니다.
일반적으로 순수한 물에서 자란 얼음은 Prism과 Pyramidal Plane에서 더 빠르게 성장하여 육각형 결정 구조를 가지게 됩니다. AFP를 첨가하면 얼음 결정의 특정 평면에 선택적으로 결합하고, 얼음 결정이 그러한 평면들로 완전히 덮이게 되어 얼음 결정의 모양이 변화됩니다. 이때 곡률이 클수록 Gibbs-Thomson 효과가 더 강하게 작용하여 순수한 물보다 훨씬 낮은 온도에서 얼게 되고 얼음 결정의 성장이 억제됩니다.
그러나 AFP는 생체 유래 단백질이기 대문에 대량 생산 비용이 높고 안정성이 낮아 상용화가 어렵다는 점, 그리고 단백질 특성 상 면역반응 및 활성의 변동성이 발생할 수 있다는 한계점이 존재합니다.
Olijve, L. L., Meister, K., Bakker, H. J. *, & Voets, I. K. *, PNAS., 113(14), 3740-3745. (2016)